方案确定使用B-25轰炸机之后，两架B-25搬上了停泊在弗吉尼亚州诺福克的大黄蜂号航母甲板，于1942年2月3日毫不费力地从航母上成功起飞。空袭计划因此迅速得到了批准，第17中型轰炸机大队前往诺福克，开始从中征募志愿者。之所以选择第17中型轰炸机大队是因为首批B-25就是分配到该大队服役的，截至1941年9月该大队的全部4个中队均已配备了B-25。第17大队不仅是美国陆军航空兵中的第一支中型轰炸机大队，而且机组人员驾驭B-25的经验也最为丰富。美国参战后，第17大队最先是隶属于陆军航空兵第8轰炸机军团。
第17大队一度在俄勒冈州尤马蒂拉县彭德尔顿(Pendleton, Umatilla County, Oregon)执行反潜巡逻任务。接到命令后，大队跨越整个美国迅速机动至位于南卡罗来纳州哥伦比亚的列克星敦县陆军航空兵基地。对外宣称将负责美国东海岸的反潜巡逻，实际则是为空袭日本作准备。大队于2月9日正式迁移至哥伦比亚，作战人员被告知他们有机会参加一项极为危险的任务，愿意参加者自愿报名。出于保密方面的考虑，对大队任何官兵都没有透露任务内容。2月17日，第17大队脱离陆军航空兵第8轰炸机军团。
初期方案中，空袭需要20架轰炸机。因此从第17大队挑选了24架B-25B米切尔轰炸机，将其运抵中部大陆航空公司(Mid-Continent Airline)位于明尼苏达州明尼阿波利斯的改造中心进行改装。具体的改装包括：
拆除机腹炮塔中的机枪;
考虑到可能会遇到比较寒冷的天气，在机翼前端和机尾安装除冰器，防止燃油冻结;
在顶部机枪周围加装通风钢板;
为防止飞机方位暴露，行动全程无线电静默，因此无线电收发器没有用处，予以拆除;
在投弹舱加装副油箱，最初使用265加仑钢制油箱，由于漏油严重而改为225加仑橡皮油箱。在投弹舱上方加装160加仑的折叠式橡皮油箱，用完里面的油料后可以将其压瘪折叠;
在机腹炮塔里安装110加仑的金属副油箱，使B-25的总燃油载重从原先的646加仑提高到1141加仑;
考虑到一旦抵达中国上空尚需时间寻找可供降落的机场，燃油仍需多带一些。所以在飞机尾部的无线电员座舱装一个60加仑和十个5加仑的小油箱，要求机枪手在飞行过程中不断将小油箱里的油料加注到炮塔副油箱里，然后在小油箱上钻上孔，再扔出飞机，使小油箱能很快沉入大海，不给日军留下任何追踪机群的痕迹;
改进炸弹舱的炸弹挂钩，使之能够在加装了副油箱的狭小空间里安装两枚227公斤的爆破弹和一枚454公斤的燃烧弹，燃烧弹为子母弹，内有128枚3千克子燃烧弹;
考虑到尾部炮塔的双管12.7毫米机枪性能并不可靠，时常出现卡壳，决定卸掉尾部机枪以减轻飞机载荷。但为了保护飞机不至于受到来自后方的攻击，因此在机尾安装了两根涂成黑色的木棍，模拟机枪枪管，这种“稻草人”机枪在实战中还颇有效果：日军飞行员远远看去，难辩真假，倒也不敢轻易从后面发动攻击;
卸下诺登投弹瞄准器，代之以查尔斯·罗斯·格里宁陆军上尉(Capt. Charles Ross Greening)发明的代用瞄准器。这是因为诺登瞄准器在当时还属于尖端科技，考虑到飞机迫降敌占区的风险，很可能会落入日军手中，因此拆除。格里宁发明的代用品非常廉价，材料仅价值20美分。由于成像色彩度不高，被同行们起了个绰号——“马克·吐温”。(马克·吐温的眼睛患有色盲症，因此同行们拿来嘲讽成像色彩度不高的瞄准器);
为了减少重量和避免起火，卸下照明弹，只在有装甲保护的飞行员座位后留了两发，供夜间着陆时使用;
改装的24架轰炸机中，在两架上安装摄影机随行抓拍轰炸效果。
与此同时，这24架飞机的机组人员全部征集完毕，前往改造中心所在地明尼阿波利斯，从1942年3月1日开始陆续驾驶改装好的24架B-25B飞往佛罗里达州的埃格林机场(Eglin Field，现埃格林空军基地)。在那里，机组人员接受为期三周的高强度训练，将第8空军基地1号辅助机场的滑行跑道涂装成航母甲板，驾驶B-25B模拟起飞，并进行低空飞行，夜航，低空投弹和水上导航。美国海军彭沙科拉航空站的亨利·L·米勒海军中尉(Lt. Henry L. Miller)监督起飞训练，后者的努力博得了杜立特赏识，被认为功不可没。杜立特中校在他的任务总结报告中提到，尽管训练的三周里出现的雨雾天气一度使训练变得不可能，但小组还是克服困难，达成了训练的预期目标。训练期间，一架B-25B在起飞时发生事故，严重受损。另有一架则在滑行时前轮发生振动。两机均因无法及时修复，被杜立特放弃。
1942年3月25日，剩下的22架B-25B从埃格林机场起飞，抵达加利福尼亚州麦克莱伦机场(McClellan Field，现麦克莱伦空军基地)。两天后飞往萨克拉门托飞机补给站进行最终的调整。接着在3月31日，总共16架确定参加任务的B-25陆续飞往加州海军阿拉米达航空站。随后，航母大黄蜂号抵达阿拉米达，其中的15架执行投弹任务，率先搬上航母。但在第16架B-25的登船问题上，海军方面担心甲板上容纳不下，故一直阻挠。杜立特团队与海军方面持续商谈，直到航母将要出发前的最后一刻，海军才同意放行，得以让第16架B-25挤上大黄蜂号甲板，参与空袭行动。整个行动始终采取高度保密措施，参与行动的所有成员直到大黄蜂从旧金山出发之后才被告知此次任务的内容。
1942年4月1日，16架经过改造的B-25轰炸机和每架5名机组成员，再加上地勤维护人员，总计71名文职和130名作战人员，从旧金山的阿拉米达登上了大黄蜂号。每架B-25配备了4枚特别定制的500磅(225公斤)炸弹。4枚炸弹中，3枚填装高爆炸药，1枚为子母燃烧弹。这种燃烧弹呈长条棒状，上百根捆绑在一起挂入投弹舱。在投出机舱后，会分散开来，大面积燃烧目标。在行动出发后由全体作战人员合影留念时，杜立特中校颇具深意地在5枚炸弹的尾翼系上了日本的“友好”奖章——都是在战前由日本政府授予美军官兵的奖章。杜立特非常明白地告诉大家，用炸弹顺路帮个忙，让这些个虚伪的奖章统统滚回老家。摄影师真实地记录下了这一场景，成了太平洋战争史上最为著名的珍贵照片之一。
轰炸机的防护方面，由于战斗机航程短无法提供护航，防护就只能仰赖机舱上方的两挺12.7毫米口径机枪和头部的一挺7.62毫米口径机枪，机腹和尾部的机枪均已拆除。所有的16架飞机按照实际起飞的顺序簇拥着排列在大黄蜂甲板之上，大黄蜂本身的舰载机只能存入甲板下的机库。
4月2日上午10时，大黄蜂带领的第18机动舰队驶离阿拉米达。数天后，由大名鼎鼎的“蛮牛”威廉·哈尔西中将指挥、以企业号航母为核心的第16机动舰队在夏威夷以北海域与第18机动舰队会合。企业号上的战斗机和巡逻机为大黄蜂号和整个舰队提供空中保护，这支特混舰队包括：
舰种 数量 中文舰名 英文舰名 舷号
航空母舰
2艘 企业号
USS Enterprise
CV-6
大黄蜂号
USS Hornet
CV-8
重型巡洋舰
3艘 盐湖城号
USS Salt Lake City
CA-25
北安普顿号
USS Northampton
CA-26
文森斯号
USS Vincennes
CA-44
轻型巡洋舰
1艘 纳什维尔号
USS Nashville
CL-43
驱逐舰
8艘 鲍尔奇号
USSBalch
DD-363
范宁号
USSFanning
DD-385
贝纳姆号
USSBenham
DD-397
埃利特号
USSEllet
DD-398
格温号
USSGwin
DD-433
梅瑞狄斯号
USSMeredith
DD-434
格雷森号
USSGrayson
DD-435
蒙森号
USSMonssen
DD-436
燃油补给舰
2艘 锡马龙号
USS Cimarron
AO-22
萨宾号 USS Sabine AO-25
第16与第18机动舰队会合后一并向西航行，全程无线电静默。4月17日下午补给舰为舰队补充完燃油之后，与8艘驱逐舰向东后撤，航母和巡洋舰继续向西，以20节的速度朝日军控制的海域快步前进。在那里，16架B-25准备起飞。
4月18日清晨7:38，机动舰队距离日本本土尚有650海里(1200公里)。就在此时，正在该海域游弋的日军巡逻船日东丸23号发现了他们，随即向日本发送无线电预警。纳什维尔号将其击沉，日东丸上除了船长自杀之外，11名船员中5人生还，被救上了纳什维尔号。
令杜立特没有想到的是，舰队尚未抵达起飞地点，竟如此早地被日军发现了。因担心接到警报的日本很可能已出动兵力前来阻击，舰队若再往前行就会非常危险。杜立特和大黄蜂号舰长马克·米切尔决定，所有B-25立即起飞——比原计划提前10小时，意味着B-25将多飞310公里。待16架B-25依次排开发动引擎之后，留给杜立特起飞的滑行距离只有467英尺(142米)。16架B-25在8:20至9:19之间的一个小时之内全部成功起飞。第16架B-25原本只随同机队进行观测和拍摄，因计划有变，杜立特决定16架B-25全部用于轰炸。对美军来说，这是第一次，也是唯一一次陆基轰炸机从航母上起飞执行任务。
起飞后的B-25陆续飞往日本，航程初期采取2到4架为一组，之后则各自散开，贴近海面低空飞行以躲避日军雷达。6小时后，16架B-25于东京时间正午时分陆续飞抵日本上空，轰炸了东京的10座军事和工业目标，横滨2座，横须贺、名古屋、神户和大阪各1座。虽然一部分B-25遇上了防空炮火以及日机的追击拦截，却没有任何B-25被击落，仅Joyce中尉的10号机轻微受伤，机身被打出了洞。16架轰炸机中，只有Holstrom中尉的4号机因机枪失灵，日机死缠不放，将炸弹扔入东京湾，未能实施轰炸。
轰炸结束之后，16架轰炸机中的15架沿着日本南部海岸向西南飞往中国东部，按照杜立特的计划，浙江境内的几座(尚未被日军占领的)机场会亮起灯塔指引他们降落，然后经加油后再飞往重庆——国民党的战时首都。几座机场中最主要的，也是最容易找到的就是衢州。另外1架则因为燃油消耗过快，在明显撑不到中国海岸的情况下，前往海岸更近的苏联。
事实证明，计划没有变化来得快。15架B-25飞往中国时面对意想不到的挑战： 夜幕降临、燃油所剩无几、再加上急剧恶化的天气。唯一庆幸的是飞往中国的航程中他们始终是顺风，使他们的航速提高了25节，否则他们根本无法在7小时内抵达中国上空。但处境还是非常严峻，一片漆黑的夜幕再加上糟糕的天气(有些遇上浓雾，有些则遇到大雨)，使得机组成员根本弄不清机场方位。在燃油即将耗尽的节骨眼上，机组成员们意识到计划降落的机场已无望找到，选择在陆地上空弃机跳伞或是沿着海岸实施海面迫降。这15架飞机也成就了B-25米切尔中型轰炸机的最长航程，平均达到约2250海里(4170公里)。
而飞往苏联的8号机则在海参崴以北40英里(65公里)的机场降落，B-25被苏方没收，机组人员遭到扣押。苏联并没有为难约克上尉等5人，对他们与其说是扣押，倒不如说是作为“克里姆林宫的客人”而得到优待。尽管如此，美国寻求将5人带回国的外交努力屡遭失败。最终，约克一行5人被转移至距伊朗边境仅32公里的阿什哈巴德，他们贿赂了一名搞走私的阿富汗人，由他带着5人越境进入伊朗，于1943年5月11日抵达附近的英国领事馆。
在英国外交官的帮助下，约克等人经印度搭机返回美国。事后解密的苏联档案表明，那名走私者的背后其实是苏联人民委员会情报部(NKVD，情报机构克格勃的前身)特工。当时苏联因为已经和日本签订了中立条约，不愿拿释放美国人去激怒日本。因此先将美国飞行员转移至日本情报网无法渗透的中亚，再派特工协助越狱逃脱。这样，美国人是自己“逃脱”，日本方面也无话可说。
杜立特和他的机组成员在弃机跳伞安全着陆后，得到了中国民兵和平民的帮助，其中包括美国神父约翰·伯奇(John Birch)。和其他机组成员一样，杜立特弃机跳伞后，着陆在了稻田中的一处粪堆上，幸运地保住了之前受过伤的脚踝。想到其他15架飞机很可能也和自己一样弃机跳伞，再想到同伴或许已被日军俘获，杜立特深感失望，他认为空袭行动彻底失败，队员又下落不明，自己若回国必将接受军事法庭的审讯。
