李时珍在数十年行医以及阅读古典医籍的过程中，发现古代本草书中存在着不少错误，决心重新编纂一部本草书籍。明世宗嘉靖三十一年（1552年），李时珍着手开始编写《本草纲目》，以《证类本草》为蓝本，参考了800多部书籍，其间，从嘉靖四十四年（1565年）起，多次离家外出考察，足迹遍及湖广、江西、直隶许多名山大川，弄清了许多疑难问题。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状和生长的情况。过去的本草书，虽然作了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去，所以越解释越糊涂，而且矛盾百出，使人莫衷一是。例如药物远志，南北朝著名医药学家陶弘景说它是小草，象麻黄，但颜色青，开白花，宋代马志却认为它象大青，并责备陶弘景根本不认识远志。又如狗脊一药，有的说它象萆薢，有的说它象拔葜，有的又说它象贯众，说法很不一致。在他父亲的启示下，李时珍认识到，“读万卷书”固然需要，但“行万里路”更不可少。于是，他既“搜罗百氏”，又“采访四方”，深入实际进行调查。
经过27年的长期努力，于明神宗万历六年（1578年）完成《本草纲目》初稿，时年61岁。以后又经过10年三次修改，前后共计40年。万历二十一年（公元1593年）去世。万历二十五年（1596年），也就是李时珍逝世后的第三年，《本草纲目》在金陵（今南京）正式刊行。
本草纲目
《本草纲目》，本草著作，52卷。明代李时珍(东璧)撰于嘉靖三十一年(1552年)至万历六年(1578年)，稿凡三易。此书采用“目随纲举”编写体例，故以“纲目”名书。以《证类本草》为蓝本加以变革。序例(卷1、2)相当于总论，述本草要籍与药性理论。
卷1“历代诸家本草”，介绍明以前主要本草41种。次辑录明代以前有关药物气味阴阳、五味宜忌、标本阴阳、升降浮沉、补泻、引经报使、各种用药禁忌等论述，其中又以金元诸家之论居多。卷3～4为“百病主治药”，沿用《证类本草》“诸病通用药”旧例，以病原为纲罗列主治药名及主要功效，相当于一部临证用药手册。卷5～52为各论，收药1892种，附图1109种。
其总例为“不分三品，惟逐各部；物以类从，目随纲举。”其中以部为“纲”，以类为“目”，计分16部(水、火、土、金石、草、谷、菜、果、木、服器、虫、鳞、介、禽、兽、人)60类。各部按“从微至巨”、“从贱至贵”，既便检索，又体现出生物进化发展思想。部之下为60类，各类中常将许多同科属生物排列在一起。各药“标名为纲，列事为目”，即一药名下列8个项目(即“事”)。其中“释名”列举别名，解释命名意义；“集解”，介绍药物出产、形态、采收等；“辨疑”(或“正误”)，类集诸家之说，辨析纠正药物疑误；“修治”，述炮炙方法；“气味”、“主治”、“发明”，阐述药性理论，提示用药要点，其下每多作者个人见解；“附方”，以病为题，附列相关方剂。
